🧬Protocolos de laboratorio

1. Extracción de ADN

La extracción de ADN es un paso esencial en los protocolos de biología molecular, ya que proporciona el material genético necesario para estudios posteriores, como la amplificación mediante PCR. En este práctico, el interés se centra en el gen TAS2R38, cuya variabilidad genética está relacionada con la percepción del sabor amargo.

Se utilizarán dos enfoques: 1. Un método de laboratorio ideal para obtener ADN puro y de alta calidad. 2. Un método casero, accesible y didáctico, basado en detergente, sal y alcohol para precipitar el ADN.

Método 1: Extracción Manual en Laboratorio

Materiales

Reactivos	Insumos	Equipos
Solución tampón de extracción: (10 mM Tris–HCl, pH 7.8; 5 mM EDTA; 0.55% SDS) Proteinasa K (20 mg/mL) Acetato de amonio 10 M Isopropanol frío Etanol al 70% Agua libre de nucleasas	Tubos eppendorf de 1.5 mL Micropipetas Tips	Centrífuga Baño maría a 65ºC Congelador -20°C

Procedimiento

1. Recolectar la saliva en tubos eppendorf de 1.5 ml utilizando un cubreobjetos

2. Centrifugar la saliva entera a 10.000 g durante 5 minutos.

3. Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 mL de tampón de extracción.

4. Añadir 5 μL de proteinasa K y agitar.

5. Incubar a 56 °C durante mínimo 2 horas. Realizar preferiblemente un overnight

6. Centrifugar brevemente y añadir 500 μL de acetato de amonio 10 M.

7. Mezclar manualmente durante y centrifugar a 10 000 g por 30 min a temperatura ambiente.

8. Transferir 500 μL del sobrenadante a un nuevo tubo y añadir 540 μL de isopropanol frío.

9. Mezclar 15 segundos y refrigerar a -20°C durante 30 minutos

10. Centrifugar a 10.000 g durante 20 min.

11. Descartar sobrenadante y lavar el pellet con 0,5 mL de etanol al 70%.

12. Lavar el pellet 2 veces con etanol 70%, secar al aire.

13. Centrifugar a 10.000 g por 5 min y dejar secar

14. Resuspender el ADN en 30 ul de agua libre de nucleasas

Para complementar este material, las y los participantes podrán visualizar un video demostrativo del procedimiento de extracción de ADN. En este recurso audiovisual se muestra paso a paso cómo realizar la práctica de manera sencilla. El video puede descargarse en el siguiente enlace:

Método 2: Extracción Casera

Materiales

Reactivos	Insumos
½ cdta. de sal (2,5 g) 1 cdta. de jabón líquido (2,5 mL) 100 mL de agua 100 mL de alcohol comercial frío (70%)	Vaso o recipiente Cuchara Agitador

Procedimiento

1. Recolectar la mayor cantidad posible de saliva en un recipiente, estimulando con movimientos de lengua.

2. Realizar la mezcla de lisis: Agua, sal y detergente, agitar suavemente evitando formar espuma

3. Mezclar la muestra de saliva con la solución de lisis. Agitar suavemente evitando formar espuma

4. Verter con cuidado el alcohol frío por el borde del vaso (formará una capa).

5. Esperar 5 minutos para observar la aparición de hebras blancas de ADN en la capa intermedia.

6. Usar un palillo para enrollar el ADN y visualizarlo.

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2. Amplificación por PCR alelo específica

En este taller, utilizaremos una variante llamada PCR Alelo-Específica (AS-PCR), diseñada para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs). Esta técnica emplea primers específicos que solo se alinean y permiten la amplificación si hay coincidencia exacta entre el 3’ del oligonucleótido y el alelo presente en el ADN.

Para identificar los genotipos del gen TAS2R38 asociados al sabor amargo, se realizarán dos reacciones de PCR por muestra:

• Una con el primer reverso específico para el alelo C (PAV: asociado a “taster”).

• Otra con el primer reverso específico para el alelo G (asociado a “non-taster”).

Ambas reacciones comparten un primer forward común y un control interno, que sirve para verificar que la reacción ha funcionado correctamente, incluso si no se detecta el alelo en cuestión.

Esta estrategia permite determinar el genotipo del SNP (A49P: aminoácido 49) sin necesidad de realizar digestiones enzimáticas o secuenciaciones. Los resultados se analizarán por electroforesis en gel de agarosa, donde la presencia o ausencia de bandas indicará el genotipo del individuo evaluado.

Materiales y reactivos

Componentes	1X
Buffer de amplificación	2.5 uL
dNTPs (10 mM)	1 uL
Primer Fwd (10 mM)	1 uL
Primer RV (10 mM)	1 uL
Enzima polimerasa	1 uL
Templado (1 -200 ng/uL)	2
DMSO	1 uL

Secuencias de Primers Utilizados

SNP (TAS2R38 A49P):

• 2R38-F: 5’-GGTGGCAACCAGGTCTTTAG-3’

• 2R38C-R: 5’-CACAATCACTGTTGCTCAGTGC-3’ - TASTER

• 2R38G-R: 5’-CACAATCACTGTTGCTCAGTGG-3’ - NON TASTER

• 2R38ci-R: 5’-GATGGCTTGGTAGCTGTGGT-3’ - CONTROL INTERNO

Programa de amplificación

Etapa	Temperatura	Tiempo	Ciclos
Desnaturalización inicial	95°C	30s	1X
Desnaturalización	95°C	30s	35X
Annealing (alineamiento)	52°C	30s
Extensión	72°C	1 min
Extensión final	72°C	5min	1X
Almacenamiento	4°C	infinito

3. Electroforesis en gel de agarosa

Procedimiento de preparación de geles de agarosa

Para este práctico, se utilizará gel de agarosa al 1.5%, adecuado para fragmentos de tamaño típico de PCR (200–1500 pb).

Preparación para 50 mL de gel al 1.5%:

Preparación de las muestras (productos de PCR)

1. Mezclar 5 µL del producto de PCR con 1 µL de loading dye.

2. Cargar cuidadosamente la mezcla en los pocillos del gel.

3. Cargar 5 µL del marcador de peso molecular en uno de los carriles.

4. Conectar la fuente de poder (80–120 V) durante 30–45 min.

Visualización y análisis

1. Observar las bandas fluorescentes bajo luz UV o luz azul del transiluminador

2. Comparar el tamaño del amplicón con el marcador de peso molecular.