📓Material de apoyo y conceptos clave
1. ADN
El Ácido Desoxirribonucleico (ADN) es la molécula que almacena la información genética en casi todos los organismos vivos. Está formado por dos cadenas complementarias que se enrollan en una doble hélice y se componen de cuatro bases nitrogenadas: Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) y Guanina (G).
La secuencia de estas bases funciona como un código que contiene las instrucciones necesarias para producir proteínas, responsables de la mayoría de las funciones celulares y de las características observables de los individuos.
2. PCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular que permite amplificar millones de copias de un fragmento específico de ADN a partir de una pequeña cantidad inicial.
El proceso se realiza en un termociclador y se basa en ciclos repetidos de tres etapas principales:
Desnaturalización (94–95 °C): las dos hebras del ADN se separan.
Alineamiento (50–65 °C): los primers se unen a las secuencias específicas que delimitan el fragmento de interés.
Extensión (72 °C): la enzima Taq polimerasa añade nucleótidos libres (dNTPs) para sintetizar nuevas hebras de ADN.
Gracias a esta técnica, a partir de una mínima cantidad de ADN es posible obtener suficiente material para su análisis, lo que la convierte en una herramienta fundamental en la investigación, el diagnóstico y la enseñanza de la biología molecular.
Componentes de una PCR:
ADN molde (extraído de la saliva)
Es el material genético a partir del cual se obtiene la secuencia de interés. En este caso, corresponde al ADN presente en las células de la saliva, que contiene el gen TAS2R38.
Primers específicos (forward y reverse) para cada alelo específico
Son pequeños fragmentos de ADN diseñados para unirse de manera específica al inicio y al final de la región que se desea amplificar. Estos actúan como puntos de partida para que la enzima pueda copiar el fragmento seleccionado.
Taq polimerasa (enzima termoestable)
Es la enzima responsable de copiar el ADN. Se denomina termoestable porque mantiene su actividad incluso a las altas temperaturas del ciclo de PCR, lo que la hace ideal para este proceso.
dNTPs (nucleótidos libres)
Representan las unidades básicas que la polimerasa incorpora para construir nuevas cadenas de ADN. Son los bloques esenciales que permiten la síntesis de copias exactas de la región objetivo.
Buffer de reacción (con MgCl₂)
Proporciona el ambiente químico adecuado para que la reacción se lleve a cabo. El ion Mg²⁺ actúa como cofactor indispensable para la polimerasa, garantizando su correcta actividad.
Agua libre de nucleasas
Se utiliza para ajustar el volumen final de la reacción. Es libre de nucleasas para evitar la degradación del ADN o de los primers, preservando la integridad de los componentes.
3. El gen TAS2R38 y el SNP-49
El gen TAS2R38 forma parte de la familia de genes TAS2R, responsables de codificar receptores gustativos especializados en la detección del sabor amargo. Dentro de este gen, uno de los polimorfismos más estudiados es el que ocurre en la posición 49, donde puede encontrarse el aminoácido Prolina (P) o Alanina (A), esta variación es conocida como SNP-49
Genotipo (posición 49)
Fenotipo
Percepción del amargor
P/P (Prolina – Prolina)
Taster (catador intenso)
Perciben fuertemente el sabor amargo
A/A (Alanina – Alanina)
Non-taster (no catador)
No perciben o perciben muy débilmente el sabor amargo
P/A (Prolina – Alanina)
Taster intermedio
Perciben el amargor en una intensidad moderada
¿Qué es un SNP?
Un SNP (del inglés Single Nucleotide Polymorphism) es una variación genética que ocurre cuando un solo nucleótido (A, T, C o G) en la secuencia del ADN es reemplazado por otro. Estas variaciones son muy comunes en el genoma humano y constituyen la forma más frecuente de diversidad genética entre individuos.
Si en una secuencia de ADN aparece la base C y en otra persona esa misma posición tiene una G, el codón resultante puede producir un aminoácido distinto. Este cambio puede alterar la forma en que la proteína trabaja, tal como sucede en el gen TAS2R38.
Relación con el sabor amargo (TAS2R38)
En el SNP-49 del gen TAS2R38, el cambio de un solo nucleótido determina si la proteína tiene Prolina (P) o Alanina (A) en esa posición.
Con Prolina (P), el receptor reconoce con mayor eficacia compuestos amargos como la feniltiocarbamida (PTC) y el PROP.
Con Alanina (A), la capacidad de detección se reduce notablemente.
Nucleótido
Codón resultante
Aminoácido
Haplotipo asociado
Secuencia
C
CCA
Prolina (P)
PAV (Taster)
G
GCA
Alanina (A)
AVI (Non-taster)
Durante este taller, se estudiará precisamente este SNP en la posición 49 del gen TAS2R38. A través de una técnica de PCR alelo-específica (AS-PCR), se podrá detectar si una persona posee:
Dos alelos con Prolina (P/P) → Taster intenso.
Dos alelos con Alanina (A/A) → Non-taster.
Un alelo de cada tipo (P/A) → Taster intermedio.
PCR Alelo-específica (AS-PCR)
La PCR alelo-específica (AS-PCR) es una variante de la PCR convencional diseñada para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs). Su principio básico consiste en el uso de primers específicos, cuyos extremos 3’ coinciden exactamente con el alelo que se desea identificar.
En este práctico, la AS-PCR se aplica al SNP-49 del gen TAS2R38, donde la variante puede ser Prolina (P) o Alanina (A):
Amplificación con el primer de Prolina (P) indica un taster.
Amplificación con el primer de Alanina (A) indica un non-taster.
Amplificación con ambos indica un taster intermedio
Electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN en función de su tamaño. El ADN, por su carga negativa, migra a través de un gel de agarosa hacia el polo positivo al aplicar un campo eléctrico. Los fragmentos más pequeños migran más rápido y lejos que los más grandes. Por lo tanto, la técnica de electroforesis se basa en la carga y el tamaño de la molécula.
Componentes
Componente
Función
Agarosa
Forma la matriz sólida donde migra el ADN
Buffer TAE/TBE
Mantiene el pH y conduce la corriente eléctrica
Colorante de carga (Loading dye)
Da peso y color a la muestra para observar su migración
Marcador (ladder)
Sirve como referencia del tamaño de los fragmentos de ADN
Ecogel / EtBr / SYBR Safe
Intercalan en el ADN para permitir su visualización fluorescente
Fuente de poder
Aplica el voltaje necesario para la migración del ADN
Porcentaje del gel de agarosa
La concentración de agarosa en el gel determina la resolución de fragmentos de ADN. Geles con mayor porcentaje separan mejor los fragmentos pequeños; en cambio, porcentajes bajos son más adecuados para fragmentos grandes.
% de Agarosa
Rango de tamaño de ADN (pb)
Aplicación típica
0.7%
800 – 10,000
Fragmentos grandes (ADN genómico)
1.0%
500 – 8,000
Fragmentos medianos a grandes (PCR estándar)
1.2%
400 – 7,000
Fragmentos medianos (PCR estándar)
1.5%
200 – 3,000
Fragmentos pequeños a medianos
2.0%
50 – 1,000
Fragmentos pequeños, minipreps, digestiones cortas
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